三鹿事件：三聚氰胺检测方法汇总

品质管理

三鹿奶粉事件沸沸扬扬，各地致病患儿的致命成分——三聚氰胺检测方法汇总　　检测方法
　　GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺
　　Spectra-Quad实现三聚氰胺含量在线检测
　　超高效液相色谱_电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺
　　反相高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量
　　高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺
　　高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中三聚氰胺的含量
　　高效液相色谱-四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量
0 I9 p; b# q3 [　　固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺
　　液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)分析宠物食品中三聚氰胺
, o1 h& x6 r# t; n% T8 L6 L　　液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留
9 C8 A9 x& y& G4 Y% A　　GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺
　　附：三聚氰胺检测方法示例
　　仪器与条件
" I2 P/ ^. S9 E* I+ p7 m& R4 z" g　　高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(DAD)，检测波长240nm，柱温：40℃。
　　(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×250mm);缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min。
; K* n6 g# j3 H9 {, R3 _- j　　(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×250mm);流动相：缓冲液：乙腈=85：15;缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min;
　　离子交换固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX
　　试剂与样品
" J5 v: n& ?  c; t, s　　宠物饲料样品(农业部饲料供应中心提供);甲醇、乙腈为北京艾杰尔科技有限公司提供;氨水、乙酸铅、三氯乙酸、均购于北京化学试剂公司;三聚氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠(Sigma公司);甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。
　　实验方法
0 p2 C5 i$ @  ?' Y2 T　　1、样品前处理方法
　　(1)标准样品配制：
. F8 Z+ Y6 I5 P1 O　　取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提取液(0.1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。
% z/ \* _: O; h0 g! Z# o% \; O　　(2)提取：
3 x! h: Q7 t" l+ h　　称取饲料样品5g，加入50ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声20min。
　　然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3mL过混合型阳离子交换小柱(PCX)。
5 j+ g+ T# n! R* T$ }$ r　　(3)净化(PCX小柱，60mg/3mL)：
　　a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
( i3 ], x& g- R+ _9 b/ m0 i7 a　　b)上样：加入提取液3mL
) F7 K5 g# i. W( c' t% G, I　　c)淋洗：3mL水;3mL甲醇;弃去淋洗液并将小柱抽干。
9 d$ }7 K) l( |% Q9 g) e* B2 I7 {　　d)洗脱：5mL5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。
　　e)浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。
4 U. S5 `; M0 G　　2、三聚氰胺被立案
　　2.1三聚氰胺HPLC-UV检测方法
　　三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局(FDA)的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果：
　　(a)色谱柱：VenusilASBC84.6×250mm;标准：FDA方法;流动相：缓冲液：乙腈=85：15;缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min;柱温：40oC;波长：240nm
　　(b)色谱柱：VenusilASB-C184.6×250mm;标准：中国农业部颁标准方法;缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min;柱温：40℃;波长：240nm
　　空白加水平(mg/L)回收率0.01116%0.1108%0.592%296%
　　2.2三聚氰胺LC-MS检测方法
　　由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了液质联用方法的使用;但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，不能得到较好的分离定量〔3〕。
  S5 c9 N3 ]+ X7 Z. E　　基于此问题，艾杰尔科技公司自主开发了新的方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离。因此方法中流动相不含离子对试剂，可以用于质谱检测。
　　与FDA2007年4月公布的《UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV)》相比较，该方法大大降低了最低检测限(MSD：0.5ppm;UV：2ppm)，提高了检测灵敏度。
; m1 ~* j3 `$ y( `) y2 S　　以该方法分别在ASB-C84.6×250mmASB-C184.6×250mm得到很好的谱图。
  K1 v1 r% ?) _! y& o& Z! _4 Y　　缓冲液：10mM的NH4AC;流动相：Buffer:：ACN=95：5;流速：1.0mL/min;进样量：样品先用70%ACN溶解成约1mg/mL，用ACN稀释成0.1mg/mL，进10uL;柱温：40℃;波长：240nm
7 T9 j: y& S) ]* a- F9 t; ]　　结果与讨论
　　1、阳离子交换柱(PCX)
) e" H$ U0 E. s$ T　　三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：
( V4 S7 K( Q& b7 y& K* f　　a)可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。
3 g- {% Z2 y4 ~　　b)批次重复性好。
　　c)回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。
　　2、LC-MS方法优点：
6 e) V: c% u7 `6 g) {　　(1)检测过程简便：无须添加离子对试剂，三聚氰胺就可得到良好的保留与分离，避免了配制离子对流动相的复杂过程。
　　(2)提高了检测的灵敏度：无离子对试剂，可以用于质谱检测器，大大降低了最低检测限(MSD：0.5ppm;UV：2ppm)。
4 ~$ q. W) H0 i, _% E, L　　(3)降低了检测成本：不用离子对试剂，就不再需要买价格较贵的离子对试剂了，从而降低了检测成本。
( o$ m) e- j  u& ]$ L8 K5 }  N　　(4)延长了色谱柱的使用寿命：避免了使用离子对试剂减少色谱柱寿命的影响。
　　(5)该方法所使用的色谱柱具有通用性：无论是用FDA方法、中国农业部部颁标准方法和本公司开发的LC-MS方法，使用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱均能得到一个很好的检测结果，从而给客户提供了多种选择空间。
9 {& `  R! A. h+ X8 K* R0 y　　国家食品质量监督检测中心有关人士说，在现有的国家标准奶粉检测中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。也就是说，三聚氰胺不属于常规检测项目，正常情况下，很少有人会想到去检测它。