三鹿事件：三聚氰胺检测方法汇总

品质管理

三鹿奶粉事件沸沸扬扬，各地致病患儿的致命成分——三聚氰胺检测方法汇总　　检测方法
& H3 Q, E: f: N7 j# E　　GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺
, r$ d9 Z9 r0 r0 _: t5 x　　Spectra-Quad实现三聚氰胺含量在线检测
& g! R) Z. `9 `7 \) A- T　　超高效液相色谱_电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺
　　反相高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量
　　高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺
% J! k  G& K% g6 @6 o% ^! o　　高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中三聚氰胺的含量
& `  y7 f% @. D0 M　　高效液相色谱-四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量
# ~% Q9 d- t; S; z" I5 f　　固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺
　　液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)分析宠物食品中三聚氰胺
0 i" P8 @" h  w  x# a. H7 B( A8 D　　液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留
3 m- |6 s  V- Y　　GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺
- _% ~! D9 S4 ]) K+ W　　附：三聚氰胺检测方法示例
　　仪器与条件
　　高效液相色谱仪；二极管阵列检测器(DAD)，检测波长240nm，柱温：40℃。
0 d3 U/ @& \/ r4 [2 }: H7 H: x; F　　(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×250mm);缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min。
　　(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×250mm);流动相：缓冲液：乙腈=85：15;缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min;
　　离子交换固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX
% y; P. u3 E0 E9 v. E# I& P/ ~　　试剂与样品
( e1 J# n3 Q- I: ~' R+ W　　宠物饲料样品(农业部饲料供应中心提供);甲醇、乙腈为北京艾杰尔科技有限公司提供;氨水、乙酸铅、三氯乙酸、均购于北京化学试剂公司;三聚氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠(Sigma公司);甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。
- b3 x- Q( m# b; `: q* f+ z　　实验方法
　　1、样品前处理方法
( n! b: b% a  d# s9 Z* S　　(1)标准样品配制：
3 [2 q: q& M" V5 X! H" h! Y$ Z　　取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提取液(0.1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。
　　(2)提取：
: `* i! }6 _3 F) k5 C$ ?　　称取饲料样品5g，加入50ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声20min。
　　然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3mL过混合型阳离子交换小柱(PCX)。
　　(3)净化(PCX小柱，60mg/3mL)：
3 y1 U: m% o( e% ~( k　　a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
　　b)上样：加入提取液3mL
( @  ?6 y% N( Z7 A; y, I　　c)淋洗：3mL水;3mL甲醇;弃去淋洗液并将小柱抽干。
8 B9 A4 R3 q3 [! P0 A　　d)洗脱：5mL5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。
　　e)浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。
# D5 Q4 t5 W2 S7 Q5 U  T0 ?4 b1 v& U　　2、三聚氰胺被立案
1 E$ B6 e3 \" r* y* N$ G　　2.1三聚氰胺HPLC-UV检测方法
　　三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局(FDA)的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果：
　　(a)色谱柱：VenusilASBC84.6×250mm;标准：FDA方法;流动相：缓冲液：乙腈=85：15;缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min;柱温：40oC;波长：240nm
　　(b)色谱柱：VenusilASB-C184.6×250mm;标准：中国农业部颁标准方法;缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min;柱温：40℃;波长：240nm
　　空白加水平(mg/L)回收率0.01116%0.1108%0.592%296%
　　2.2三聚氰胺LC-MS检测方法
　　由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了液质联用方法的使用;但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，不能得到较好的分离定量〔3〕。
　　基于此问题，艾杰尔科技公司自主开发了新的方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离。因此方法中流动相不含离子对试剂，可以用于质谱检测。
2 \6 r0 f+ V" g6 W# W　　与FDA2007年4月公布的《UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV)》相比较，该方法大大降低了最低检测限(MSD：0.5ppm;UV：2ppm)，提高了检测灵敏度。
　　以该方法分别在ASB-C84.6×250mmASB-C184.6×250mm得到很好的谱图。
　　缓冲液：10mM的NH4AC;流动相：Buffer:：ACN=95：5;流速：1.0mL/min;进样量：样品先用70%ACN溶解成约1mg/mL，用ACN稀释成0.1mg/mL，进10uL;柱温：40℃;波长：240nm
　　结果与讨论
　　1、阳离子交换柱(PCX)
" F' Q) {: ?; N9 W　　三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：
$ W3 B0 M* O/ s6 Q# o, n1 q$ z1 \　　a)可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。
　　b)批次重复性好。
　　c)回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。
/ J0 Y& x3 p1 Z0 k' T　　2、LC-MS方法优点：
: T) C) V* _* d* e) G' p　　(1)检测过程简便：无须添加离子对试剂，三聚氰胺就可得到良好的保留与分离，避免了配制离子对流动相的复杂过程。
2 g0 x: }+ ]9 z8 R) I! A; r2 \　　(2)提高了检测的灵敏度：无离子对试剂，可以用于质谱检测器，大大降低了最低检测限(MSD：0.5ppm;UV：2ppm)。
* K3 _% g; N0 P　　(3)降低了检测成本：不用离子对试剂，就不再需要买价格较贵的离子对试剂了，从而降低了检测成本。
# j% g; b8 j# {+ m- K9 k0 B' {　　(4)延长了色谱柱的使用寿命：避免了使用离子对试剂减少色谱柱寿命的影响。
( m$ g8 W; x8 B: f$ G　　(5)该方法所使用的色谱柱具有通用性：无论是用FDA方法、中国农业部部颁标准方法和本公司开发的LC-MS方法，使用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱均能得到一个很好的检测结果，从而给客户提供了多种选择空间。
　　国家食品质量监督检测中心有关人士说，在现有的国家标准奶粉检测中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。也就是说，三聚氰胺不属于常规检测项目，正常情况下，很少有人会想到去检测它。